原代細(xì)胞分離：

一、細(xì)胞培養(yǎng)

1取材 在無菌環(huán)境下從機(jī)體取出某種組織細(xì)胞（視實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ǎ?，?jīng)過一定的處理（如消化分散細(xì)胞、分離等）后接入培養(yǎng)器血中，這一過程稱為取材。如是細(xì)胞株的擴(kuò)大培養(yǎng)則無取材這一過程。機(jī)體取出的組織細(xì)胞的培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。2培養(yǎng) 將取得的組織細(xì)胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過程稱為培養(yǎng)。3凍存及復(fù)蘇（可參閱后面有關(guān)章節(jié)）為了保存細(xì)胞，特別是不易獲得的突變型細(xì)胞或細(xì)胞株，要將細(xì)胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度－196℃，將細(xì)胞收集至凍存管中加入含保護(hù)劑（一般為二甲亞砜或甘油）的培養(yǎng)基，以一定的冷卻速度凍存，保存于液氮中。在極低的溫度下，細(xì)胞保存的時(shí)間幾乎是無限的。復(fù)蘇一般采用快融方法，即從液氮中取出凍存管后，立即放入37℃水中，使之在一分鐘內(nèi)迅速融解。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)器皿中進(jìn)行培養(yǎng)。

二、原代細(xì)胞分離

凡是來源于胚胎、組織器官及外周血，經(jīng)特殊分離方法制備而來的原初培養(yǎng)的細(xì)胞稱之為原代細(xì)胞。1懸浮細(xì)胞的分離方法組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，簡(jiǎn)單的方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘。經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。2實(shí)體組織材料的分離方法對(duì)于實(shí)體組織材料，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細(xì)胞充分分散，形成細(xì)胞懸液，可采用機(jī)械分散法（物理裂解）和消化分離法。

三、細(xì)胞增殖檢測(cè)技術(shù)

目前主要有兩種用于檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的方法。一種是直接的方法，通過直接測(cè)定進(jìn)行分裂

的細(xì)胞數(shù)來評(píng)價(jià)細(xì)胞的增殖能力。另一種是間接的方法，即細(xì)胞活力（cell viability）檢測(cè)方法，通過檢測(cè)樣品中健康細(xì)胞的數(shù)目來評(píng)價(jià)細(xì)胞的增殖能力。顯然，細(xì)胞活力檢測(cè)法并不能終證明檢測(cè)樣品中的細(xì)胞是否在增殖。如細(xì)胞在某一培養(yǎng)條件下會(huì)自發(fā)啟動(dòng)凋亡程序，但的干擾可抑制凋亡的發(fā)生；這時(shí)若采用細(xì)胞活力檢測(cè)法，顯然可以區(qū)分兩種條件下的細(xì)胞數(shù)量，但我們并不能從干擾組細(xì)胞數(shù)大于對(duì)照組的事實(shí)說明可促進(jìn)細(xì)胞增殖的結(jié)論。所以直接的證據(jù)應(yīng)該采用方法一。

其中常見檢測(cè)：CCK8檢測(cè)法 ，MTT檢測(cè)法，Brdu檢測(cè)法，Edu檢測(cè)法，平板克隆形成。

四、細(xì)胞周期檢測(cè)技術(shù)

細(xì)胞周期指由細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次細(xì)胞分裂結(jié)束所經(jīng)歷的過程，所需的時(shí)間叫細(xì)胞周期時(shí)間。

常用的方法：流式檢測(cè)細(xì)胞周期，標(biāo)記有絲分裂百分率法。

五、細(xì)胞凋亡檢測(cè)

常見檢測(cè)方法：流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡，線粒體膜電位，活性氧檢測(cè)，Hoechst染色，電鏡，TUNEL。

訂購信息：

產(chǎn)品名稱：A431(A-431)細(xì)胞

貨號(hào)：BJ-100347

【培養(yǎng)指南】

對(duì)于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

2. 加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞|細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3. 按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4. 將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

對(duì)于懸浮細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細(xì)胞，1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

方法二：可選擇半數(shù)換液方式，棄去半數(shù)培養(yǎng)基后，將剩余細(xì)胞懸起，將細(xì)胞懸液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

【細(xì)胞凍存】

待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行293/HEK-293細(xì)胞|細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入約1ml含血清的培養(yǎng)基后加入凍存管中，再添加10%DMSO后進(jìn)行凍存。懸浮細(xì)胞凍存時(shí)，應(yīng)將細(xì)胞收集，1000RPM條件下離心4分鐘，少量保存上清液(防止細(xì)胞吸走)，加入部分新鮮培養(yǎng)基，加入到凍存管中，在凍存管中加入10%DMSO后進(jìn)行凍存。

【復(fù)蘇的原則】

快速融化：必須將凍存在-196℃液氮中的細(xì)胞快速融化至37℃，使細(xì)胞外凍存時(shí)的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對(duì)細(xì)胞造成損害。復(fù)旦細(xì)胞庫各地均可發(fā)貨，統(tǒng)一價(jià)格，本公司出售的所有細(xì)胞僅供科研使用。

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆蓋整個(gè)瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入完全培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入完全培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存。

250mL Gelatin Veronal Buffer (GVB)   Gelatin Veronal Buffer (GVB)   常溫保存　　SLITRK1 抗體, 兔多抗, 抗原親和純化 ELISA    50 μg

250mL Gelatin Veronal Buffer with EDTA (GVBE)   Gelatin Veronal Buffer with EDTA (GVBE)   常溫保存　　CD225 抗體, 兔多抗, 抗原親和純化 WB   IHC-P   IP   50 μg

250mL Gelatin Veronal Buffer with Mg++ and Ca++ (GVB++)   Gelatin Veronal Buffer with Mg++ and Ca++ (GVB++)   常溫保存　　2B4 / SLAMF4 / CD244 抗體, 鼠單抗 ELISA    50 μg

250mL Gelatin Veronal Buffer with Mg++ and EGTA (GVBMG)   Gelatin Veronal Buffer with Mg++ and EGTA (GVBMG)   常溫保存　　PDX1 抗體, 兔多抗, 抗原親和純化 WB   IP    50 μg

500mL Gelatin-Tween in PBS   Gelatin-Tween in PBS   常溫保存　　2B4 / SLAMF4 / CD244 抗體, 兔多抗 ELISA    400 μg

500mL Gelatin-Tween in TBS  Gelatin-Tween in TBS  常溫保存　　2B4 / CD244 抗體, 兔單抗 WB   IP    50 μg

125mL Glucose Solution（葡萄糖溶液）,1M  Glucose Solution,1M  常溫保存　　2B4 / CD244 抗體, 兔單抗 ELISA    50 μg

250mL Glucose Solution（葡萄糖溶液）,20%（W/V) Glucose Solution,20%（W/V) 常溫保存　　IFITM1 抗體, 兔單抗 IHC-P    50 μg

250ml Glucose Veronal Buffer (GVB)   Glucose Veronal Buffer (GVB)   常溫保存　　2B4 / SLAMF4 / CD244 抗體, 兔多抗, 抗原親和純化 ELISA    50 μg

250ml Glucose Veronal Buffer with EDTA(GVBE)   Glucose Veronal Buffer with EDTA(GVBE)   常溫保存　　GGT1 抗體, 兔多抗, 抗原親和純化 WB   IHC-P    50 μg

250ml Glucose-Gelatin Veronal Buffer (GGVB)   Glucose-Gelatin Veronal Buffer (GGVB)   常溫保存　　cd207 抗體, 兔多抗, 抗原親和純化 WB   IP    50 μg

250ml Glucose-Gelatin Veronal Buffer with EDTA (GGVBE)   Glucose-Gelatin Veronal Buffer with EDTA (GGVBE)   常溫保存　　CD49C 抗體, 兔多抗, 抗原親和純化 IHC-P    50 μg

250ml Glycerol Solution（甘油溶液），20% Glycerol Solution，20% 常溫保存　　ADAM17 / CD156b 抗體, 兔多抗, 抗原親和純化 IP    50 μg

A431(A-431)細(xì)胞飲料檸檬酸比色法定量檢測(cè)試劑盒  進(jìn)口/國(guó)產(chǎn) 規(guī)格：20次

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