細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆蓋整個(gè)瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入完全培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入完全培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

原代細(xì)胞分離：

訂購信息：

英文簡稱：HIMEC細(xì)胞

產(chǎn)品名稱：腸微血管內(nèi)皮細(xì)胞

貨號：BJ-01X10509

規(guī)格：腸微血管內(nèi)皮細(xì)胞

形態(tài)特性:DMEM

生長特性:貼壁

【培養(yǎng)指南】

對于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

2. 加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞|細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3. 按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4. 將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

對于懸浮細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細(xì)胞，1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

方法二：可選擇半數(shù)換液方式，棄去半數(shù)培養(yǎng)基后，將剩余細(xì)胞懸起，將細(xì)胞懸液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

【細(xì)胞凍存】

待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行293/HEK-293細(xì)胞|細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入約1ml含血清的培養(yǎng)基后加入凍存管中，再添加10%DMSO后進(jìn)行凍存。懸浮細(xì)胞凍存時(shí)，應(yīng)將細(xì)胞收集，1000RPM條件下離心4分鐘，少量保存上清液(防止細(xì)胞吸走)，加入部分新鮮培養(yǎng)基，加入到凍存管中，在凍存管中加入10%DMSO后進(jìn)行凍存。

【復(fù)蘇的原則】

快速融化：必須將凍存在-196℃液氮中的細(xì)胞快速融化至37℃，使細(xì)胞外凍存時(shí)的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對細(xì)胞造成損害。復(fù)旦細(xì)胞庫各地均可發(fā)貨，統(tǒng)一價(jià)格，本公司出售的所有細(xì)胞僅供科研使用。

一、細(xì)胞培養(yǎng)

1取材 在無菌環(huán)境下從機(jī)體取出某種組織細(xì)胞（視實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ǎ?，?jīng)過一定的處理（如消化分散細(xì)胞、分離等）后接入培養(yǎng)器血中，這一過程稱為取材。如是細(xì)胞株的擴(kuò)大培養(yǎng)則無取材這一過程。機(jī)體取出的組織細(xì)胞的培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。2培養(yǎng) 將取得的組織細(xì)胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過程稱為培養(yǎng)。3凍存及復(fù)蘇（可參閱后面有關(guān)章節(jié)）為了保存細(xì)胞，特別是不易獲得的突變型細(xì)胞或細(xì)胞株，要將細(xì)胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度－196℃，將細(xì)胞收集至凍存管中加入含保護(hù)劑（一般為二甲亞砜或甘油）的培養(yǎng)基，以一定的冷卻速度凍存，保存于液氮中。在極低的溫度下，細(xì)胞保存的時(shí)間幾乎是無限的。復(fù)蘇一般采用快融方法，即從液氮中取出凍存管后，立即放入37℃水中，使之在一分鐘內(nèi)迅速融解。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)器皿中進(jìn)行培養(yǎng)。

二、原代細(xì)胞分離

凡是來源于胚胎、組織器官及外周血，經(jīng)特殊分離方法制備而來的原初培養(yǎng)的細(xì)胞稱之為原代細(xì)胞。1懸浮細(xì)胞的分離方法組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，簡單的方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘。經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。2實(shí)體組織材料的分離方法對于實(shí)體組織材料，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細(xì)胞充分分散，形成細(xì)胞懸液，可采用機(jī)械分散法（物理裂解）和消化分離法。

三、細(xì)胞增殖檢測技術(shù)

目前主要有兩種用于檢測細(xì)胞增殖能力的方法。一種是直接的方法，通過直接測定進(jìn)行分裂

的細(xì)胞數(shù)來評價(jià)細(xì)胞的增殖能力。另一種是間接的方法，即細(xì)胞活力（cell viability）檢測方法，通過檢測樣品中健康細(xì)胞的數(shù)目來評價(jià)細(xì)胞的增殖能力。顯然，細(xì)胞活力檢測法并不能終證明檢測樣品中的細(xì)胞是否在增殖。如細(xì)胞在某一培養(yǎng)條件下會(huì)自發(fā)啟動(dòng)凋亡程序，但的干擾可抑制凋亡的發(fā)生；這時(shí)若采用細(xì)胞活力檢測法，顯然可以區(qū)分兩種條件下的細(xì)胞數(shù)量，但我們并不能從干擾組細(xì)胞數(shù)大于對照組的事實(shí)說明可促進(jìn)細(xì)胞增殖的結(jié)論。所以直接的證據(jù)應(yīng)該采用方法一。

其中常見檢測：CCK8檢測法 ，MTT檢測法，Brdu檢測法，Edu檢測法，平板克隆形成。

四、細(xì)胞周期檢測技術(shù)

細(xì)胞周期指由細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次細(xì)胞分裂結(jié)束所經(jīng)歷的過程，所需的時(shí)間叫細(xì)胞周期時(shí)間。

常用的方法：流式檢測細(xì)胞周期，標(biāo)記有絲分裂百分率法。

五、細(xì)胞凋亡檢測

常見檢測方法：流式檢測細(xì)胞凋亡，線粒體膜電位，活性氧檢測，Hoechst染色，電鏡，TUNEL。

SSBP2  抑癌基因SSDP2抗體規(guī)格: 0.2ml

ST5/DENND2B  抑癌蛋白5抗體規(guī)格: 0.2ml

TCHP  抑癌蛋白TCHP抗體規(guī)格: 0.2ml

TUSC1  肺癌抑癌蛋白1抗體規(guī)格: 0.2ml

TUSC3  前列腺癌抑癌蛋白3抗體規(guī)格: 0.2ml

TUSC5  抑癌基因5抗體規(guī)格: 0.2ml

Tomoregulin-1  腦腫瘤抑癌蛋白1抗體規(guī)格: 0.2ml

VILIP1  神經(jīng)視錐蛋白樣1抗體(神經(jīng)鈣蛋白)規(guī)格: 0.2ml

ZNF185  鋅指蛋白185抗體規(guī)格: 0.2ml

RBMX  糖蛋白P43抗體規(guī)格: 0.2ml

PRB2/p130  視網(wǎng)膜母  瘤相關(guān)蛋白p130抗體規(guī)格: 0.1ml

p95 NBS1/Cell cycle regulatory protein p95    周期調(diào)節(jié)蛋白P95抗體規(guī)格: 0.2ml

phospho-p95 NBS1(Ser343)  磷酸化滑膜  凋亡抑制物1抗體規(guī)格: 0.1ml

腸微血管內(nèi)皮細(xì)胞即用型平板培養(yǎng)基  

50T 鵝特定基因序列PCR檢測試劑盒   低溫運(yùn)輸，-20℃保存

10mL 戊二醛，25% 水溶液 Glutaraldehyde Solution    室溫保存

5mL 神經(jīng)元生長因子 Growth Factor For Cell Culture -20℃保存

7-乙基喜樹堿 7-Ethylcamptothecin 78287-27-1  20mg

含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂（TSA-YE）顆粒  300ml*10

10mg 氨甲喋呤 Amethopterin -20℃保存

10管 種保存液（用于液體培養(yǎng)的細(xì)） Stain Storage Soluiton 4℃保存

水平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基 Water Plate Count Agar 250g

50T 魚特定基因序列PCR檢測試劑盒   低溫運(yùn)輸，-20℃保存

50T 志賀ipaH 基因(610bp)常規(guī)PCR檢測試劑盒  低溫運(yùn)輸，-20℃保存

25 mg SPQ（6-甲氧基-N-（3-磺丙基）） Fluorescent Probe and Tracer -20℃保存

含225ml磷酸鹽緩沖液均質(zhì)袋 Phosphate Buffered Saline 10個(gè)/包