PCR反應的特異性決定因素為:
①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合;
②堿基配對原則;
③Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性;
④靶基因的特異性與保守性。
其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應的忠實性及Taq DNA聚合酶耐高溫性,使反應中模板與引物的結(jié)合(復性)可以在較高的溫度下進行,結(jié)合的特異性大大增加,被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū),其特異性程度就更高。
(2) 靈敏度高
PCR產(chǎn)物的**量是以指數(shù)方式增加的,能將皮克(pg=10-12g)量級的起始待測模板擴增到微克(ug=10-6g)水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞;在病毒的檢測中,PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位);在學中zui小檢出率為3個。
(3) 簡便、快速
PCR反應用耐高溫的Taq DNA聚合酶,一次性地將反應液加好后,即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應,一般在2~4 小時完成擴增反應。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析,不一定要用同位素,無放射性污染、易推廣。
(4) 對標本的純度要求低
不需要分離病毒或及培養(yǎng)細胞,DNA 粗制品及總RNA均可作為擴增模板??芍苯佑门R床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活PCR技術(shù)概論。
訂購信息:
產(chǎn)品名稱:鮑肌肉萎縮癥病毒熒光-PCR法
英文名稱:Abalone Shriveling Syndromeassociated Virus(AbSV)PCR
貨號:BJ-01R3211
產(chǎn)品規(guī)格:50T
運輸:低溫
保存:負20度
有效期:一年
貨期:現(xiàn)貨
【儲存條件及有效期】:
-20℃避光保存,避免反復凍融,有效期6個月。
【適用儀器】:
ABI7300、ABI7500、LightCycler 480、iCycleriQ5、CFX96、SLAN等熒光定量PCR儀。
【樣本采集、存放及運輸】:
u 樣本采集:各類型樣本按照常規(guī)方法采集;
u 存放:樣本在2~8℃條件下保存應不超過72h,-70℃以下可長期保存,但應避免反復凍融(多凍融3次);
u 運輸:采用**或泡沫箱加冰密封進行運輸。
本公司產(chǎn)品僅用于科研。
【自備試劑】:
核酸提取試劑,如QIAGEN QIAamp Viral RNA Mini試劑盒,也可選擇其他合適的核酸提取產(chǎn)品。
組成及試劑配制:
1、 酶標板:一塊(96孔)
2、 標準品(凍干品): 2瓶,請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml,蓋好后室溫靜置大約10分鐘,同時反復顛倒/搓動以助溶解,其濃度為200 U/L,然后做系列倍比稀釋(注:不要直接在板中進行倍比稀釋),分別配制成200 U/L,100 U/L,50 U/L,25 U/L,12.5 U/L,6.25 U/L,3.12 U/L,樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標準品:取0.3ml (不要少于0.3ml )200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,混勻即可,其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液:1×20ml。
4、 檢測稀釋液A:1×10ml。
5、 檢測稀釋液B:1×10ml。
使用方法:
一、樣品 RNA 的制備
1、用自選方法抽提病毒樣品 RNA。注意:可以選用本公司生產(chǎn)的一管式病毒 RNAout
2、或柱式病毒 RNAout。
二:RT(逆轉(zhuǎn)錄)反應合成 cDNA
1. 按下表配制 RT 反應體系(20 μL 體系)
2. 70℃保溫 5 分鐘變性模板后立即冰浴。
3. 嚴格按順序加入 6μL RT Buffer(含 dNTP)和 2μL MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(含 RI),
反應終體積為 20μL。
4. 42℃保溫 60 分鐘。此步為 RT 反應。
5. 70℃保溫 10 分鐘以終止反應,然后放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以直接作為 PCR 模板使用,丌需要純化。
實驗注意事項:
1)RT-PCR可以檢測組織、細胞、血液、等很多材料,不同的樣本有不同要求,實驗前請充分溝通確認實驗方案和樣本情況;
2)客戶盡可能提供實驗的背景信息、物種、基因準確的名稱和ID號;
3)客戶盡量不要提供DNA或RNA樣品。
4)樣本保存于液氮或干冰,也可以保存于Trizol液中。
實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)是指在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程,通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。實時熒光定量PCR的化學原理包括探針類和非探針類兩類,探針類是利用與靶細胞序列特異性雜交的探針來指示擴增產(chǎn)物的增加,非探針類是利用熒光染料或者特異性設計的引物來指示擴增的增加。運用該技術(shù)可以對DNA、RNA樣品進行定量(包括量和相對定量)和定性分析。
主要服務:DNA或RNA的定量分析、基因表達差異分析、基因分型。
主要技術(shù):引物設計、RNA提取、cDNA合成、qPCR。
5-Methoxy-2-benzimidazolethiol 5g AL 8810 isopropyl ester 50mg Deltaline 50mg
Ceramide 10mg Galactose 1-phosphate Potassium salt 50mg CMP-Sialic Acid (sodium salt) 500μg
TSU-68 (SU6668,Orantinib) 1mg 4-amino-1,8-Naphthalimide 10mg Borrelia Bavarriensis 58 10mM(in1mLDMSO)
25-Hydroxycholesterol 10mg Biricodar (VX-710) 10mM(in1mLDMSO) Seviteronel racemate 25mg
LY2940680 10mg Fradafiban (BIBU-52) 5mg FAB-144 5μg
Lesopitron dihydrochloride (E4424) 50mg N3PT 5mg SHH Mouse 5mg
1,2,3-Trilinoelaidoyl-rac-glycerol 5μg Heptadecanoyl Ethanolamide 1mg HSPB11 Human 1mg
Nithiamide 5mg JWH 018 N-(2,2-dimethylpropyl) isomer 20μg GST 5g
NVP-TNKS656 100? Lesinurad sodium 10mM*1mLinDMSO 17,20-dimethyl Prostaglandin F1α 50mg
H-Ala-OtBu.HCl 10mM(in1mLDMSO) Homovanillic Acid sulfate (sodium salt) 10mg Fesoterodine Fumarate 1g
NSP-805 10mM*1mLinDMSO 11-deoxy Prostaglandin E1 1mg Memantine Lactose Adduct 1g
HSF1A 10mg CCG 2046 10mg Ro 15-4513 10mg
9(R)-HETE 2mg PVALB Human 10mg HPSE WB 1mg
Ac-Lys-NHMe 5mg FASLG Human 1mg ADX-47273 10μg
XAV-939 1mg KCTD5 Human 10mg Z-Phe-Phe-Phe-OH 1mg
鮑肌肉萎縮癥病毒熒光-PCR法染料木苷 英文名稱Genistin 含量:HPLC≥98% 20mg/支 γ-taxilin/LSR5 脂多糖相關(guān)反應蛋白5抗體 0.2ml
歐前胡素 英文名稱imperatorin 含量:HPLC≥98% 20mg/支 T4/L-Thyroxine 甲狀腺素T4抗體 0.2ml
異歐前胡素 英文名稱isoimperatorin 含量:HPLC≥98% 20mg/支 HLA G(N-Terminus) 人類白細胞抗原G抗體(N端) 0.1ml
遠志酸 英文名稱Polygalacic acid 含量:HPLC≥99% 20mg/支 HLA G(C-terminal) 人類白細胞抗原G抗體(C端) 0.1ml
遠志皂苷元 英文名稱Senegenin 含量:HPLC≥99% 20mg/支 hemagglutinin protein/H 麻疹病毒血凝素抗體 0.2ml
萊苞迪甙A 英文名稱Rebaudioside A 含量:HPLC≥98% 20mg/支 WIG-1/PAG608 野生型P53誘導基因1抗體 0.1ml
黃芩苷 英文名稱Baicalin 含量:HPLC≥98% 20mg/支 CD71/TFR/Transferrin receptor 轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體 0.1ml
野黃芩苷(燈盞花乙素) 英文名稱Scutellarin 含量:HPLC≥98% 20mg/支 GAPDH(3E12)-Loading Control 3-磷酸甘油醛脫氫酶單克隆抗體(內(nèi)參抗體) 0.1ml
黃芩素 英文名稱Baicalein 含量:HPLC≥98% 20mg/支 GAPDH 3-磷酸甘油醛脫氫酶抗體(內(nèi)參抗體) 0.1ml