使用方法:

一、樣品 RNA 的制備

1、用自選方法抽提病毒樣品 RNA。注意：可以選用本公司生產(chǎn)的一管式病毒 RNAout

2、或柱式病毒 RNAout。

二：RT（逆轉(zhuǎn)錄）反應(yīng)合成 cDNA

1. 按下表配制 RT 反應(yīng)體系（20 μL 體系）

2. 70℃保溫 5 分鐘變性模板后立即冰浴。

3. 嚴(yán)格按順序加入 6μL RT Buffer（含 dNTP）和 2μL MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（含 RI），

反應(yīng)終體積為 20μL。

4. 42℃保溫 60 分鐘。此步為 RT 反應(yīng)。

5. 70℃保溫 10 分鐘以終止反應(yīng)，然后放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以直接作為 PCR 模板使用，丌需要純化。

訂購信息：

產(chǎn)品名稱：交鏈孢霉屬通用熒光-PCR法

英文名稱：Alternaria spp.PCR
貨號：BJ-01R3251

產(chǎn)品規(guī)格：50T

運(yùn)輸：低溫

保存：負(fù)20度

有效期：一年

貨期：現(xiàn)貨

【儲存條件及有效期】:

-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融，有效期6個月。

【適用儀器】:

ABI7300、ABI7500、LightCycler 480、iCycleriQ5、CFX96、SLAN等熒光定量PCR儀。

【樣本采集、存放及運(yùn)輸】：

u 樣本采集：各類型樣本按照常規(guī)方法采集；

u 存放：樣本在2~8℃條件下保存應(yīng)不超過72h，-70℃以下可長期保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（多凍融3次）；

u 運(yùn)輸：采用**或泡沫箱加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸。

本公司產(chǎn)品僅用于科研。

【自備試劑】:

核酸提取試劑，如QIAGEN QIAamp Viral RNA Mini試劑盒，也可選擇其他合適的核酸提取產(chǎn)品。

組成及試劑配制:

1、 酶標(biāo)板：一塊（96孔）

2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

3、 樣品稀釋液：1×20ml。

4、 檢測稀釋液A：1×10ml。

5、 檢測稀釋液B：1×10ml。

實驗注意事項：

1）RT-PCR可以檢測組織、細(xì)胞、血液、等很多材料，不同的樣本有不同要求，實驗前請充分溝通確認(rèn)實驗方案和樣本情況；

2）客戶盡可能提供實驗的背景信息、物種、基因準(zhǔn)確的名稱和ID號；

3）客戶盡量不要提供DNA或RNA樣品。

4）樣本保存于液氮或干冰，也可以保存于Trizol液中。

實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實時熒光定量PCR的化學(xué)原理包括探針類和非探針類兩類，探針類是利用與靶細(xì)胞序列特異性雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，非探針類是利用熒光染料或者特異性設(shè)計的引物來指示擴(kuò)增的增加。運(yùn)用該技術(shù)可以對DNA、RNA樣品進(jìn)行定量（包括量和相對定量）和定性分析。

主要服務(wù)：DNA或RNA的定量分析、基因表達(dá)差異分析、基因分型。

主要技術(shù)：引物設(shè)計、RNA提取、cDNA合成、qPCR。

PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：

①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；

②堿基配對原則；

③Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實性；

④靶基因的特異性與保守性。

其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實性及Taq DNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。

(2) 靈敏度高

PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12g)量級的起始待測模板擴(kuò)增到微克(ug=10-6g)水平。能從100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達(dá)3個RFU(空斑形成單位)；在學(xué)中zui小檢出率為3個。

(3) 簡便、快速

PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在2～4 小時完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。

(4) 對標(biāo)本的純度要求低

不需要分離病毒或及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA 粗制品及總RNA均可作為擴(kuò)增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活PCR技術(shù)概論。

4-Methylumbelliferyl β-D-N,N’-diacetylchitobioside  50μg  Undecanoic Acid  10mg  Ac-Endothelin-1 (16-21), human  5mg

Gusacitinib (ASN-002)  20μg  Nodakenetin  1mg  AdipoRon  5mg

BEBT-908 (PI3Kα inhibitor 1)  25mg  Boc-Ser(tBu)-OH  10μg  Azido-PEG4-alcohol  5g

5-trans-17-phenyl trinor Prostaglandin F2α ethyl amide  250mg  SPA, His  2μg  11-dehydro-2,3-dinor Thromboxane B2  5mg

15-OxoEDE  10mg  C17 D-erythro/L-threo Sphingomyelin (d18:1/17:0)  10mg  Moclobemide (Ro 111163)  1mg

Prednisone  10mg  NPPC Human  5mg  Triacontanoic Acid methyl ester  50mg

KLK15 Human  10mg  RAN Human  1mg  ARC 239 dihydrochloride  5mg

Lassa Capsid  50mg  TGFB2 Human, HEK  10mg  Veratric acid (3,4-Dimethoxybenzoic acid)  1mg

HSV-8 M  10mg  SCAND1 Human  5mg  BAY 73-6691 racemate  5mg

CALR Human  250mg  Capsiconiate  50mg  2-Thenoyltrifluoroacetone  5μg

SERPINA9 Mouse  50mg  K-115  10mM*1mLinDMSO  D-Luciferin  50mg

Isoescin IA  2μg  3-arylisoquinolinamine derivative  100μg  1-Deoxysphingosine (m18:1(14Z))  50mg

Org-26576  100g  H-D-Tyr-Val-Gly-OH  10μg  Fmoc-Dab(Fmoc)-OH  5mg

BRD-6929  1g  Cirsimaritin  5mg  JWH 018 2’-naphthyl-N-(1-ethylpropyl) isomer  100mg

PF 915275  10mg  KU 55933  5g  LY335979 (Zosuquidar 3HCL)  0.1mg

交鏈孢霉屬通用熒光-PCR法膽酸（錯誤） 英文名稱Cholic Acid 含量：HPLC≥98% 20mg/支 CD24  CD24抗體規(guī)格: 0.1ml

膽紅素 英文名稱Bilirubin 含量：HPLC≥98% 20mg/支 APOE/Apo E2  載脂蛋白E抗體規(guī)格: 0.1ml

大葉茜草素 英文名稱Rubimaillin 含量：HPLC≥98% 20mg/支 PIRH2  泛素連接酶抗體規(guī)格: 0.1ml

斷血流皂苷A 英文名稱Clinodiside A 含量：HPLC≥98% 20mg/支 Calponin 1/2/3  鈣結(jié)合蛋白Calponin抗體規(guī)格: 0.2ml

羥基紅花黃色素A 英文名稱hydroxysafflor yellow A 含量：HPLC≥98% 20mg/支 SORBS2/ArgBP2  精氨酸結(jié)合蛋白2抗體規(guī)格: 0.2ml

琥珀酸（丁二酸） 英文名稱Butane diacid 含量：HPLC≥98% 20mg/支 SLC40A1/FPN1  細(xì)胞膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白FP1抗體規(guī)格: 0.1ml

槐角堿 英文名稱 含量：HPLC≥98% 20mg/支 TGF beta 3  轉(zhuǎn)移生長因子β3（TGFβ3）抗體規(guī)格: 0.1ml

胡蘆巴堿 英文名稱trigonelline 含量：HPLC≥98% 20mg/支 TGF beta 1/LAP  轉(zhuǎn)化生長因子β（TGFβ）抗體規(guī)格: 0.1ml

瑞香素（祖師麻甲素） 英文名稱Daphnetin 含量：HPLC≥98% 20mg/支 TGF beta 2  轉(zhuǎn)化生長因子β2（TGFβ2）抗體規(guī)格: 0.1ml